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亞硫酸氫鈉測序（BSP）實驗步驟由普拉特澤生物分享，亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則不變。通過設計針對甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，將符合預期的產(chǎn)物純化回收連接T載體，進行陽性克隆測序即可獲取某個特定基因區(qū)段內(nèi)每個CpG位點的甲基化程度。普拉特澤生物表達檢測平臺長期為廣大科研人員提供亞硫酸氫鈉測序外包服務，本文咱們就一起來看看BSP實驗的詳細操作步驟吧~

1、引物設計

在GenBank上找到待檢基因啟動子區(qū)的原始序列，輸入到“MethPrimer”軟件中，輸入啟動子序列，選擇“Pick primers for bisulfite sequencing PCR?or restriction PCR?”，其他參數(shù)選擇程序默認值，點擊“Submit”，“MethPrimer”軟件即可顯示預測的啟動子序列的CpG島，及引物的相應位置，同時也顯示設計的BSP引物。選擇多對引物進行預實驗，最終確定引物序列。

2、基因組提取

使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（實驗步驟見PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分別提取各樣本基因組。提供的細胞量要求大于10^6個。提取濃度在100-400 ng/μL之間，OD 260/280均在1.8-2.0之間，提取質(zhì)量合格。

3、亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

（1）將提取獲得的基因組DNA 3 μg以無菌雙蒸水稀釋至50μl，然后加入NaOH （終濃度為0.2 M）在42℃水浴變性30 min。

（2）依次加入30μl 10mM對苯二酚（氫醌）、520μl 3 M亞硫酸氫鈉（pH=5.0要求精準）至上述水浴后混合液中，輕柔顛倒混勻。

（3）加入200μl石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；50℃避光水浴16h。

4、修飾后DNA純化回收

修飾后的DNA使用純化試劑盒進行過柱純化，回收后用50μl無菌雙蒸水溶解，并測定濃度。

5、PCR擴增

PCR引物設計、退火溫度選擇、Taq酶及Buffer的選擇都會影響擴增的成敗，需要不斷優(yōu)化。

6、擴增產(chǎn)物回收

將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，進行膠回收，步驟如下：在紫外燈下，切下包含目的片段的膠條。用天平稱量總重量并減去空管的重量算出凝膠的重量，按100mg=100μL來計算凝膠的體積，并加入1倍凝膠體積的Binging Solution置于65℃水浴鍋內(nèi)將凝膠徹底融化。期間適當搖晃EP管，加快凝膠的溶解。

將上述液體全部轉(zhuǎn)移到濾柱內(nèi)，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復一次）。然后棄掉管內(nèi)液體，向柱內(nèi)加入500μL的WA Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S。棄掉管內(nèi)液體，再向柱內(nèi)加入500μL的Wash Solution，13000轉(zhuǎn)離心30S（可重復一次）。然后空離3 min。將濾柱放置在一個新的1.5mL EP管中，室溫晾干。最后在柱子內(nèi)加入35 μL的ddH2O，靜置5min，13000轉(zhuǎn)離心90s。為了提高回收率，可將溶解的DNA再次加入柱子內(nèi)離心一分鐘。棄掉柱子，回收的即為擴增產(chǎn)物片段，并測定濃度。

7、進行重組反應

將回收的擴增片段與T克隆載體進行重組，完成回收目的基因與載體的重組過程。

8、轉(zhuǎn)化

（1）將感受態(tài)細胞置于冰上（4℃）待其自然解凍后，取10 μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中，于冰上（4℃）放置30 min。

（2）之后于42℃水浴中熱擊90 S，然后迅速置于冰上（4℃）放置2-3 min。

（3）加入500μL不含抗生素的SOC培養(yǎng)基于37℃,225rpm振蕩培養(yǎng)45 min。

（4）3000轉(zhuǎn)離心2 min，棄掉900μL的上清液，將管底的菌液吹打散開，加入到含有載體上對應抗性（氨芐或卡那等）的培養(yǎng)平板中，用滅菌的涂布器涂勻（涂布器的溫度不能太高，以免燙死菌體），倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。

9、克隆鑒定

挑起平板多個克隆轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，陽性克隆子再進行測序鑒定，保證最終拿到5個有效樣品測序數(shù)據(jù)。

好啦，那關于亞硫酸氫鈉測序BSP測序的詳細操作步驟咱們就講到這里啦，是不是很細節(jié)呢？如果您還有什么實驗問題或有BSP檢測外包的需求歡迎隨時咨詢哦~

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