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大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起來學習探針法檢測SNP的詳細操作步驟，SNP全稱單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組上單個核苷酸的變異，變異類型包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。普拉特澤——表達檢測平臺專業(yè)承接SNP檢測代做外包服務與生物醫(yī)學細胞實驗技術(shù)培訓，鑄就你基礎醫(yī)學科研的金身。那現(xiàn)在我們來一點一點看Taqman探針法檢測SNP的詳細內(nèi)容！

Taqman探針法將樣品與反應組分在封閉的體系中進行簡單混合，通過檢測PCR反應過程中的熒光變化，可以實時檢測SNP位點的基因分型。由于無需任何PCR之后的操作，這樣就避免了PCR之后的人力成本與PCR后處理過程中的交叉污染。由于PCR反應的靈敏性，這種方法需要的樣本含量極少。同時，隨著日益成熟的熒光定量PCR儀，可以在一個反應板中進行大批量樣本的同時檢測。

Taqman探針法檢測SNP的原理是：利用Taq DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活力對探針本身進行酶切。Taqman探針的兩端分別標記有熒光基團和對應的淬滅基團，當探針完整時，oligo相當于一條鎖鏈將熒光基團和淬滅基團緊緊拴在一起，導致熒光基團發(fā)出的光被淬滅基團吸收。當探針被Taq酶切斷之后，熒光基團得以釋放從而導致熒光值上升，熒光值的變化會被熒光定量PCR儀或者其他檢測儀器記錄下來。

對于SNP分型檢測，體系中會含有針對不同基因型的探針（如下圖Probe1和Probe2），兩種探針5端通過標記不同的熒光基團進行區(qū)分（通常使用的是FAM和VIC）。他們的序列中包含匹配不同基因型的堿基，堿基錯配將導致探針與模板的結(jié)合能力以及被切割的概率大大降低。因此，當基因型為純合子時，只會檢測到單獨一種熒光信號，而對于雜合子，兩種熒光信號都將被檢測到。

那有哪些因素會影響到探針對SNP分型效果呢？

首先，探針中錯配的堿基需要對整條探針與模板的結(jié)合能力有比較大的影響，即含有錯配的探針Tm值需比正常探針低得多。這對探針的長度及SNP位點在探針中的位置有較高的要求。

第二，由于分型探針是在同一個反應體系中，因此不同的探針與模板的結(jié)合是一種競爭狀態(tài)，這就要求不同的分型探針與模板結(jié)合的位置是需要重疊的，這樣才能保證一個模板上只結(jié)合一種探針。

第三，Taqman探針的水解是先解離一部分，然后再水解。Taq酶的5’核酸外切酶活性實際上識別的是一個Y型結(jié)構(gòu)，其游離的單鏈至少為1~3個核苷酸，此時要求錯配的探針應當更傾向于從模板上解離下來，而不是繼續(xù)留在模板上被Taq酶水解。

為了能得到最合適的實驗結(jié)果，我們列出了探針設計的各種原則：
1. 避免5’端第一個核苷酸為G，鳥嘌呤核苷酸對臨近的熒光基團有明顯的淬滅作用，導致結(jié)果信號值低。

2. 探針的Tm值需要比引物的Tm值高5~8°C，通常情況下為65~67°C

3. 為了增加探針的單堿基區(qū)分度，探針長度不宜過長，但同時MGB探針也不宜短于13個核苷酸。

4. 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，尤其是連續(xù)的G，多余4個連續(xù)的G存在時，探針容易形成G四聯(lián)體或其他高級結(jié)構(gòu)，不利于其與模板的結(jié)合。

5. 區(qū)分SNP的堿基應當位于探針中間1/3的位置去（將探針平分三段，SNP位于中間那段）。如果這段位置不合適，設計不出優(yōu)秀的探針，可以將SNP位置向3’端挪動，以更加靠近MGB基團。不要將SNP分型位點安排到最后的三個核苷酸中。

6. 由于G核苷酸形成高級結(jié)構(gòu)及對熒光團的淬滅特性，探針的G殘基數(shù)量不宜超過C的數(shù)量，如果有此情況，建議將探針設計在互補鏈上。

好啦，那關(guān)于Taqman探針法檢測SNP分型咱們就講解到這里啦，如果您還有其他的問題或者有SNP檢測代做的需求歡迎隨時官網(wǎng)留言，我們下期見~

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