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流式檢測細(xì)胞周期原理及實(shí)驗(yàn)步驟分析——科研小白

大家好，今天我們來講一講用流式檢測細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)原理和詳細(xì)步驟，本文是普拉特澤生物根據(jù)承接的幾千例流式檢測外包實(shí)驗(yàn)與同學(xué)們的技術(shù)咨詢分析，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分來外包實(shí)驗(yàn)和技術(shù)咨詢的問題都是流式檢測相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，特別是流式檢測細(xì)胞周期，既然這個(gè)實(shí)驗(yàn)折磨了大家這么久，那這一篇，我們就來好好地給科研小白們盤一盤吧！

一、流式檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)原理

流式利用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記的單克隆抗體，與待測成分作用，然后上流式細(xì)胞儀檢測待測細(xì)胞。待測細(xì)胞隨流動(dòng)室內(nèi)的流動(dòng)鞘液排列成單列，一個(gè)個(gè)迅速通過激光聚焦區(qū)，激光在對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行照射時(shí)可同時(shí)得到前向角散射和側(cè)向角散射2種散射光以及激發(fā)熒光標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)，利用這些信號(hào)，可計(jì)算出相對(duì)含量，從而得到細(xì)胞群的相對(duì)比值。

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能（G0期）。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量（2N），而G2/ M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期。

流式檢測細(xì)胞周期

二、流式檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟

1、培養(yǎng)細(xì)胞周期待測細(xì)胞：在合適的溫度、營養(yǎng)、酸堿度條件下通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，可以借此研究細(xì)胞周期、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長增殖等實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間：一般藥物等處理時(shí)間最好是大于細(xì)胞增殖一代的周期，可根據(jù)具體細(xì)胞分裂時(shí)間決定，如乳腺癌細(xì)胞我們一般處理24小時(shí)。這里就不展開講啦，感興趣的同學(xué)可以看看另一篇文章：原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)該用什么方法？

2、收集檢測細(xì)胞周期的細(xì)胞：收集細(xì)胞取適量的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6厘米中，在相應(yīng)的條件下(如藥物)處理相應(yīng)時(shí)間后，倒去培養(yǎng)基，用胰酶適度消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，棄去上清。細(xì)胞數(shù)量:一般情況下，由于在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1.0*104~3.0*104才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，單次流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)，1份樣品的細(xì)胞數(shù)量至少為106。

3、清洗及固定檢測細(xì)胞周期的細(xì)胞：用PBS清洗細(xì)胞2遍，吸凈離心管殘余的PBS后，加入300微升PBS重懸，將細(xì)胞吹散，避免細(xì)胞成團(tuán)，隨后將細(xì)胞懸液逐滴滴入700uL無水乙醇(預(yù)冷)，即用70-75%的乙醇固定細(xì)胞，然后4℃固定過夜。由于流式分析時(shí)需要的是單個(gè)細(xì)胞懸液，因此在操作過程中需充分混懸細(xì)胞，細(xì)胞固定后，不可過度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片。

4、再次洗滌檢測細(xì)胞周期的細(xì)胞：第二天，離心收集細(xì)胞，用移液槍吸走上清，然后用1mLPBS重懸細(xì)胞并離心清洗2~3遍。細(xì)胞可以長期保管在-20℃，可存放1個(gè)月，染色不會(huì)受影響;用PBS重懸細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作要輕柔。此外，離心速度(1200rpm/min)不要過快以免造成細(xì)胞的破裂。

5、避光孵育待測細(xì)胞：RNA酶消化和PI染色在避光條件下，每個(gè)樣品加入1避光RNase(10mg/mL)和5 mg/m(5mg/mL)混勻后室溫避光條件下孵育30min

6、上流式細(xì)胞儀檢測：將檢測樣品轉(zhuǎn)移到5mL的流式管后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，采用flowjo或 modifit軟件進(jìn)行DNA含量分析，上機(jī)檢測時(shí)，必須重懸成細(xì)胞懸液后再檢測，否則容易堵儀器管道；如果細(xì)胞過多或聚團(tuán)嚴(yán)重，可先用300尼龍網(wǎng)過濾，然后再上機(jī)檢測。
那么以上就是用流式檢測細(xì)胞周期的原理和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟啦，關(guān)于流式的結(jié)果分析怎么看，請(qǐng)點(diǎn)擊：流式結(jié)果怎么看【干貨分享】
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